Morfogénesis in vitro en el género Tagetes: Una revisión

A V A N C E S E N H O R T I C U L T U R A – R E V I E W

In vitro morphogenesis in genus Tagetes: A review

Morfogénesis in vitro en el género Tagetes: Una revisión

Zapata, C. ^1*, Serrato, M.¹, Rodríguez, J. L. ¹ y Guerra, D. ¹

¹Facultad de Fitotecnia, Departamento de Horticultura, Universidad Autónoma Chapingo, Carr. Federal México - Km 38.5, 56230 Texcoco, México.

*Autor para correspondencia: ch.zapatam@gmail.com

Recibido: 19/07/2021 Aceptado: 25/11/2021

ABSTRACT

Zapata, C., Serrato, M., Rodríguez, J. y Guerra, D. 2022. In vitro morphogenesis in genus Tagetes: A review.Horticultura Argentina 41 (104): 200-216.

About 50% of species of the botanical family Asteraceae have been studied in relation to their morphogenesis capacity in vitro; in the case of the genus Tagetes, only 5% of the species have been explored. Research on the in vitro culture of cells, tissues and organs of this genus was reviewed as a basic reference to explore other species, highlighting the critical role of factors involved in in vitro morphogenesis of Tagetes. Calllogenesis is promoted by a ratio of auxin and cytokinin concentrations, and 2,4-dichlorophenoxyacetic acid is a frequent inducer of callus; Another auxin used successfully has been naphthaleneacetic acid. Organogenesis is influenced by the type of growth regulators and the auxin / cytokinin ratio. The best responses have been recorded using indoleacetic acid, naphthaleneacetic acid, benzyladenine and kinetin; The genotype is also important, since a relationship of growth regulators can induce shoots in one species or variety, but in another it can generate different responses. To induce direct organogenesis, gibberellins play an important role, since they inhibit callus formation. Embryogenesis is regulated by the auxin / cytokinin ratio; being 2,4-D, supplemented with benzyladenine the most used. These factors to induce morphogenesis basically correspond to domesticated species, and it is expected that such factors will be useful for ruderal, weed or wild species of this genus.

Additional keywords: organogenesis, callogenesis, embryogenesis, cempoalxochitl, explants.

RESUMEN

Zapata, C., Serrato, M., Rodríguez, J. y Guerra, D. 2022. Morfogénesis in vitro en el género Tagetes: Una revisión. Horticultura Argentina 41 (104): 200-216.

Cerca del 50 % de especies de la familia botánica Asteraceae se ha estudiado en relación con su capacidad de morfogénesis in vitro.En el caso del género Tagetes, solamente el 5 % de las especies está explorado. Investigaciones sobre el cultivo in vitro de células, tejidos y órganos de este género se revisaron como referencia básica para explorar otras especies, destacando escasez de estudios relacionados, y el papel crítico de factores involucrados en morfogénesis in vitro en la mayoría de las especies de Tagetes. El objetivo del presente artículo fue poner en contexto la situación actual de la morfogénesis in vitro del género Tagetes. La callogénesis se promueve mediante una relación de concentraciones de auxinas y citocininas, y el ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) es frecuente inductor de callos; otra auxina utilizada exitosamente ha sido el ácido naftalenacético (ANA). La organogénesis, principalmente está influida por el tipo de reguladores de crecimiento y la relación auxina/citocinina, las mejores respuestas se han registrado usando ácido indolacético (AIA), ANA, benciladenina (BA) y kinetina (KIN). También es importante el genotipo, ya que una relación de reguladores de crecimiento puede inducir brotes en una especie o variedad, pero en otra puede generar respuestas diferentes. Para inducir organogénesis directa, las giberelinas juegan un papel importante, ya que inhiben la formación de callo. La embriogénesis está regulada por la relación auxina/citocinina. La auxina que mayormente ha favorecido el proceso de embriogénesis es el 2,4-D, y en algunos casos ANA suplementado con BA.

Palabras claves adicionales:organogénesis, callogénesis,embriogénesis, cempoalxóchitl, explantes.

1. Introducción

La capacidad morfogénica de las células y tejidos vegetales in vitro ha brindado oportunidades para numerosas aplicaciones de biotecnología vegetal en estudios de botánica básica, bioquímica, propagación, reproducción, desarrollo de cultivos transgénicos, entre otros (Phillips, 2004).

La técnica de cultivo in vitro de plantas ha ido avanzando desde 1914 hasta el presente; durante 1914 a 1930 se estudió la respuesta de morfogénesis de plantas gimnospermas, y posterior a 1930, se dio paso a las plantas angiospermas (CAB, 2020). Actualmente en Asteraceae solo se tienen exploradas alrededor de 60 % de las especies (GBIF, 2019; CAB, 2020).

En el caso del género Tagetes (Asteraceae), un taxón que evolucionó como endémico del Continente Americano, únicamente hay antecedentes sobre el cultivo in vitro de cuatro especies (Tabla 1 - Tabla 4), de las 53 identificadas hasta ahora (List, 2021). La evolución química en este taxón le ha conferido, entre otras propiedades, la de pigmentante, germicida, saborizante, aromatizante y antioxidante, útiles para diversas aplicaciones en agricultura, medicina e industria (Santos et al., 2015; Riaz et al., 2020). La disponibilidad de este recurso natural indica que 30 especies se ubican en Centro y Norteamérica, mientras que en Sudamérica se encuentran 23 (Plant list, 2021); en México cerca de 26 especies se tienen registradas (Turner, 1996; Serrato, 2014). En la perspectiva de ampliar el conocimiento sobre morfogénesis in vitro de Tagetes y su aplicación biotecnológica por las propiedades que contiene, en este trabajo se revisaron contribuciones científicas sobre el tema de morfogénesis in vitro en el género con la finalidad de destacar factores críticos relacionados con el crecimiento y diferenciación celular, como marco de referencia para investigaciones experimentales sobre especies de Tagetes aún sin explorar. Si bien se consigna un trabajo previo de revisión documental sobre el cultivo in vitro de Tagetes (Dekka & Arjuna, 2014), este es muy general, refiriendo pocos trabajos sobre la especie T. erecta, toda vez que posterior a 2014 hay más publicaciones sobre este tema, lo que limita precisar aspectos críticos de los factores involucrados en la morfogénesis in vitro en este género.

2. Género Tagetescomo modelo de estudio

Los trabajos publicados sobre Tagetes cifran cerca de 4239 en el periodo 1934 a 2019 con un incremento notable en el siglo XXI (CAB, 2020), lo que posiciona a este género como importante. Las especies de Tagetesse han estudiado por sus propiedades alelopáticas, además de considerarlas como alternativa potencial en el manejo de plagas y enfermedades en la agricultura (Correa et al., 2017), ya que las plantas de este género contienen metabolitos secundarios con acción biológica de amplio espectro (Taype et al., 2021), además de propiedades antioxidantes, germicidas, hipotensoras, espasmolíticos y antiinflamatorias importantes en la medicina (Iannacone et al., 2017; Cruz et al., 2021).

La falta de estudios químico-biológico de la mayoría de las especies de Tagetes es notable, particularmente no se ha explorado su cultivo in vitro, toda vez que la importancia de esta biotecnología es básica en los aspectos siguientes: conservación de la diversidad biológica, producción de moléculas en biorreactores (Maschke et al., 2015), multiplicación vegetativa rápida (Majumder et al., 2014), propágulos de alta sanidad (Karjee et al., 2020), bioseguridad en transferencia de germoplasma (FAO, 2018), inserción artificial de genes (Gupta & Rahman, 2015), aumento de variación somaclonal (Ramírez & Iglesias, 2015), estudios de mutagénesis (Jyoti et al., 2016), inducción de metabolitos secundarios a la planta para mejorar resistencia a plagas (Kumar et al., 2018), y recuperación de plantas infectadas con virus (Bhardwaj et al., 2005), entre otros.

Desde 1934 hasta el presente, se han publicado alrededor de 359 trabajos sobre Tagetes en los que se ha recurrido al modelo de estudio in vitro, pero sólo 30 de estos se relacionan con el cultivo de células, tejidos y órganos (CAB, 2020). La realización de estos trabajos sobre regulación de morfogénesis abarca el periodo de 1946 hasta la actualidad, destacando las publicaciones de India y Estados Unidos, en forma secundaria Argentina, China, Australia, Dinamarca, República de Corea, México, Países Nórdicos, Arabia Saudita, Pakistán y Yemen (CAB, 2020). La especie T. erectaes una de las más estudiadas ya que se le considera una planta de gran demanda comercial debido a sus usos como ornamental e industrial, además de su valor medicinal (Deka & Arjuna, 2014). Aunque T. erecta, T. patula y T. minuta, por su importancia industrial y ornamental, son las especies más estudiadas en el modelo in vitro, hay otras especies del taxón que también presentan propiedades químicas y biológicas de interés, pero no se les ha explorado su capacidad morfogénica.

3. Morfogénesis vegetal in vitro

La morfogénesis se define como la génesis de órganos y comprende crecimiento y diferenciación celular. En células o tejidos cultivados in vitro, el proceso de morfogénesis puede inducirse porque las células vegetales, bajo determinados estímulos, son capaces de desdiferenciarse y/o diferenciarse; esta plasticidad celular se conoce como totipotencia celular (Fehér, 2019). La morfogénesis puede seguir dos vías: organogénesis y embriogénesis, ambas pueden ocurrir sin una etapa intermedia de callo, o bien, siguiendo una etapa del callo no organizado (De Almeida et al., 2015). Los factores de tratamiento típicos incluyen: elección del explante, composición del medio de cultivo, fuentes y concentraciones del regulador de crecimiento, ambiente de cultivo como la forma física del medio, pH, humedad, calidad de luz, fotoperiodo, temperatura, ambiente gaseoso y potencial osmótico (Vanneste & Friml, 2009).

4. Morfogénesis in vitro de Tagetes

Además del conocimiento sobre inducción, mantenimiento y regulación de funciones especializadas en el cultivo de callos, existen diversos reportes sobre la regeneración de plantas vía organogénesis y embriogénesis somática de T. erecta, tanto de forma directa como indirecta a partir de la rediferenciación de los callos, utilizado explantes como hojas cotiledonares, hojas maduras e hipocótilo (Bespalhok & Hattori, 1998; Mohamed et al., 1999; Misra & Datta, 2001; Venegas-Espinoza et al., 2002; García-Chavarría, 2007; Kumar et al., 2007; Banani & Anania, 2014).

La información sobre morfogénesis in vitro de Tagetescaptada de la base de datos CAB, destacan factores de interés, como la fuente de explante, método de desinfección, medio de cultivo, concentración de reguladores de crecimiento y la respuesta de morfogénesis obtenida.

5. Fuente de explante y desinfección

Como fuente de explantes, en la mayoría de los trabajos se emplean plántulas de tres semanas de edad obtenidas in vitro a partir de semillas (Vanegas-Espinoza et al., 2002; Osman et al., 2012; Majumder et al., 2014), aunque también se ha recurrido a plantas establecidas en invernadero (RunDong et al., 2012, Nikam & Khan, 2015). Los métodos de desinfección son cruciales, no solamente para evitar contaminación, sino para prevenir oxidaciones de tejidos u órganos en contacto con el medio de cultivo. Existen diferentes métodos de desinfección para algunas especies de Tagetes, entre las que sobresale el método usado para semillas de T. minuta, que consiste en una solución de hipoclorito de sodio al 10 % (BDH) y gotas de Tween 20 durante 20 min, seguida de varios lavados con agua destilada estéril (Mohamed et al., 1999). En varios trabajos se ha utilizado el método de Vanegas-Espinoza et al. (2002) como modelo para desinfectar las semillas, el cual inicia con etanol absoluto durante 1 min, después etanol al 70 % durante 5 min, seguidamente hipoclorito de sodio al 2 % con Tween 20 al 0.1 % durante 15 min y pase a hipoclorito de sodio al 1 % durante 15 min; después de cada tratamiento se enjuaga con agua desionizada; el paso final consiste en enjuagar tres veces con agua desionizada estéril.

Cuando se trata de explantes que no provienen de semillas germinadas in vitro, los procesos de desinfección cambian, y se ha encontrado que para puntas de brotes y segmentos de tallos,se cubre el material vegetal con una gasa y se lavan con agua corriente, alcohol al 70 % durante 15 seg solución de HgCl₂ al 0.1 % durante 8 min, y después de cada lavado, un enjuague con agua estéril de tres a cinco veces, finalmente se transfieren los explantes al medio de cultivo (RunDong et al., 2012); para flores liguladas jóvenes se lavan en agua corriente durante 30 min y luego se trata con Dettol (líquido antiséptico) durante 5 min, después, los tejidos se tratan superficialmente con etanol al 70 % por 30 seg, seguido de HgCl₂ al 0.1 % por 3 min, finalmente se lavan de cuatro a cinco veces con agua destilada estéril (Nikam & Khan, 2015). Para explantes de hojas, primero se lava en agua corriente y luego en agua destilada, después se transfieren los explantes a una solución de etanol al 70 % y se mantiene durante 5 min sumergidos; posteriormente se prepara una solución nueva de 0.2 % de cloruro de mercurio y se pasan los explantes a la solución durante 3-7 min, y por último se enjuaga con agua destilada estéril tres veces con vigorosa agitación (Deka & Arjuna, 2014).

6. Callogénesis

Desde 1964 hasta la actualidad, el cultivo de callosidades en el género Tagetes a partir del tejidos u órganos ha sido objeto de estudio para la producción de compuestos químicos como flavonoides, carotenoides (Yun Ji et al., 2017), terpenos, tiofenos (Gupta, Shanker & Rahman, 2016), alcaloides, piretrina (Nikam & Khan, 2015), fenoles y fenilpropanoides (Bekheet, 2015).

Explantes.En algunas especies se han tomado cotiledones, hipocótilos, flores liguladas, meristemos apicales, raíces, hojas y tallos como explantes, lo cual ha permitido conocer cuáles explantes son viables para su establecimiento in vitro. Para lograr callogénesis, en T. erecta y T. patula se usan segmentos de hoja, tallo o de raíz (Osman et al., 2008 & 2012). En T. patula también se ha intentado con meristemos apicales y segmentos de tallo (RunDong et al., 2012) y para T. erecta los segmentos de hojas jóvenes son los explantes más utilizados (Vanegas et al., 2012; Benitez-García et al., 2014).

Medio de cultivo. El porcentaje y tipo de macro y micronutrientes que conforman el medio de cultivo son importantes en la respuesta de morfogénesis.

Varios investigadores concluyen que para el caso de T. patula, el medio MS al 50 % resulta importante para la formación de callos, en comparación con T. erecta,el cual requiere que este medio de cultivo contenga el 100 % de sus macro y micronutrientes para formar callos (Vanegas et al., 2002; Osman et al., 2012; Nikam & Khan, 2014; Nikam & Khan, 2015).

Reguladores de crecimiento.A los reguladores de crecimiento se les considera de gran importancia en la expresión de morfogénesis de las plantas, en consecuencia, también de las especies de Tagetes.

En el medio de cultivo MS se han establecido explantes, suplementando con varios reguladores de crecimiento combinados. Entre los reguladores de crecimiento más utilizados en Tagetes están: auxinas como el ácido naftalenacético (ANA), ácido indol 3-acético (AIA), ácido indol 3-butírico (AIB), ácido 2,4 diclorofenoxiacético (2,4-D) y citoquininas tales como Kinetina (KIN) y Bencilaminopurina (BA). Una tasa alta de inducción de callos a partir del cultivo de hoja se puede lograr con 2, 4-D (2 mg L^-1) y BA para T. erecta(5 mg L^-1) (Nikam & Khan, 2014).

Los reguladores más usados por su acción efectiva en la formación de callos son las auxinas 2,4-D y ANA, y las citocininas BA y KIN, factores químicos que se han probado y establecido para T. erecta y T. patula,aunque de acuerdo con la mayoría de los trabajos, los mejores reguladores para callogénesis son 2,4-D y BA (Lakshmanan et al.,1997; Mohamed et al., 1999; Misra & Datta, 2001; Vanegas-Espinoza et al., 2002; Feng et al., 2012; RunDong et al., 2012).

Condiciones lumínicas. Para T. erecta y T. patula se indica que las condiciones de iluminación para un mejor desarrollo del callo es la oscuridad; en T. erecta el mejor peso fresco de callos se obtiene de las hojas en oscuridad, comparativamente con los cultivos de callos derivados de segmentos de tallo y explantes de raíz en condiciones de luz u oscuridad (Osman et al., 2008; Feng et al., 2012; Osman et al., 2012). La condición de oscuridad permite la síntesis de algunas proteínas y enzimas esenciales para el desarrollo celular (YingChun, et al., 2005; Osman et al., 2012). Sin embargo, para explantes de raíz de T. patula y de T. erecta, la producción de cultivo celular es significativamente mayor en T. patula en comparación con T. erecta,cuando los explantes se someten a condiciones de luz, en comparación con la oscuridad (Osman et al., 2012).

7. Organogénesis

Organogénesis directa se ha logrado sólo en T. erecta (García-Chavarría, 2007; Majumder et al., 2014; Nuoendagula et al., 2017) yla vía de organogénesis indirecta se ha explorado en T. erecta, T. minuta y T. patula(Bespalhok & Hattori, 1998; García-Chavarría, 2007; Osman et al., 2012); en ambas vías de organogénesis, la finalidad es hacer inducción floral, clonación, obtención de líneas puras para producción de semillas hibridas, multiplicación masiva, producción de metabolitos secundarios y transformación genética (Osman et al., 2012, Barrales et al., 2018).

Explantes. Diferentes explantes tienen diferente respuesta de morfogénesis, y para el caso de organogénesis en Tagetes se han empleado segmentos de hoja, meristemos apicales (de Lourdes et al., 2006), hipocótilos, segmentos tallo o segmentos nodales (Kumar et al., 2007), según la respuesta que se desee obtener, además de que esta respuesta puede cambiar dependiendo de la especie que se trate (Belarmino et al., 1992).

En T. erecta, T. minuta y T. patula se ha empleado segmentos de hojas jóvenes como explante ya que se han visto que es más propicio para obtener organogénesis (Misra & Datta, 2001; Vanegas et al., 2002). También se ha usado meristemos apicales como explantes, dando una alta tasa de regeneración de brotes para T. erecta (Majumder et al., 2014). Para T. patula se han usado meristemos apicales y segmentos de tallo, destacando que la diferenciación de los meristemos apicales es mejor que con segmentos de tallo (RunDong et al., 2012), resultado que también se tiene en T. erecta (Majumder et al., 2014). Hojas inmaduras y ovarios de plantas maduras también se han probado como explantes para la regeneración in vitrode plantas estériles masculinas en T. erecta (Huan Li et al., 2011). La respuesta de morfogénesis de explantes de hoja aumenta de la porción de la punta (ápice) hacia la base, fenómeno observado en otras plantas como el manzano, explicable porque las hojas de la parte distal alcanzan primero la madurez y, posteriormente, de manera basípeta la parte proximal (Kumar et al., 2019).

Medio de cultivo.Generalmente se usa el medio MS como medio de cultivo base. Misra & Datta (2001) proponen el medio MS modificado con: NH₄NO₃, (NH₄)₂SO₄, L-glutamina ± HCl, L-arginina ± HCl, sulfato de adenina (AdS) y 6-benciladenina (6-BA) para el establecimiento de brotes, de los cuales se extraen los explantes, mismos que se pueden cultivar en el medio MS con BA y AgNO₃; el AgNO₃se utiliza en explantes como segmentos de ápice de hoja, ya que este compuesto actúa como un inhibidor directo de la acción del etileno (Beyer, 1976), lo que permite una senescencia retardada que produce un buen crecimiento de los brotes proliferados, tal como ocurre en Coffea canephoracuando se usa a baja concentración, aunque a una alta puede ser perjudicial para embriogénesis (Fuentes et al., 2000).

En general, el medio MS con algunas modificaciones y con el 100 % de nutrimentos, ayuda a la regeneración de brotes, mientras que con el MS al 50 % se regenera raíces; en ambos casos, considerando sus respectivos reguladores de crecimiento, ya que estos medios de cultivo por sí solos no tendrían la misma acción de morfogénesis (Majumder et al., 2014).

Reguladores de crecimiento.Según la respuesta que se desee obtener, se han empleado diferentes tipos y relación de concentraciones de auxinas y citocininas, aunque en algunos casos también se ha hecho uso de giberelinas. En T. erecta, además de resultar útiles AIA y BA, se puede desarrollar brotes haciendo uso del ácido giberélico, el cual desempeña un papel importante en la inducción de brotes, así como en la supresión de formación de callos (de Lourdes et al., 2006; Kumar et al., 2007; ZiGang et al., 2010); también se ha observado que la auxina favorece la callogénesis, por lo que algunos investigadores utilizan solo BA y ácido giberélico (AG) como suplemento para lograr morfogénesis, debido a que en Tagetes la formación de callo en el explante de hoja es latente considerando el contenido de auxinas en el medio (Misra & Datta, 2001). El AG es propicio para la regeneración de brotes in vitro en explantes de flores de crisantemo (Chakrabarty et al., 2000) o para la promoción del crecimiento en número y alargamiento de células en ciertas especies arbóreas (Ericksson et al., 2000), por lo que el AG pueda reemplazar a la auxina en la inducción de brotes, y, en consecuencia, una proporción de citoquinina/AG puede ser decisiva para la diferenciación en ciertos tejidos de plantas (Sekiola & Tanaka, 1981). De ahí que ANA, BA (Vanegas et al., 2002) y AG (Majumder et al., 2014) puedan influir en buenos resultados de regeneración de brotes, raíces y callos.

La concentración de los reguladores de crecimiento es crucial para direccionar la respuesta de morfogénesis en Tagetes, y en el caso de T. erecta, concentraciones de BA que superan 10 mg L^-1 (por ejemplo 15 mg L^-1) son positivas en la formación de brotes en comparación con T. patula, para la cual, la concentración óptima es de 10 mg L^-1 (Osman et al., 2012); en otros trabajos se reporta que una concentración superior a 1 mg L^-1 causa vitrificación y malformación en los brotes obtenidos, siendo 0.5 mg L^-1 la mejor concentración de BA para aumentar el número de brotes por explante y tener un tamaño de brote deseado (Turchetto et al., 2007).

La vitrificación de brotes en Tagetes erecta se ha asociado al uso de concentraciones altas de BA en el medio de cultivo. Esto se ha revertido al disminuir el contenido de BA junto con la adición de nitrato de plata. Además, esta negativa se ha superado espontáneamente cuando los brotes se transfirieron al medio de enraizamiento el cual contiene mayor concentración de auxinas y menor de citocininas (Miranda-Ham et al., 2006).

Fuente de carbono. Como fuente de carbono para organogénesis se usa sacarosa en un porcentaje del 3,0% (p/v), obteniendo resultados favorables (Vanegas-Espinoza et al., 2002).

Condiciones lumínicas.Como se indicó en el apartado de callogénesis, la luz o la oscuridad son determinantes para la síntesis de ciertas enzimas. La oscuridad es un factor importante para la desdiferenciación y formación de callo, pero la condición de luz favorece la formación de brotes, además que aumenta significativamente el peso fresco celular de explantes de hojas de T. patulay T. erecta (Osman et al., 2012).

8. Embriogénesis somática

Pocos son los trabajos publicados con respecto a embriogénesis somática en Tagetes, y a continuación se destacan los factores sobresalientes para T. erecta (Bespalhok & Hattori, 1998; Venegas-Espinoza et al., 2017), única especie explorada hasta ahora.

Explantes.Bespalhok & Hattori (1998) consignan regeneración de plantas de T. erecta a partir de explantes cotiledonares; esos autores reportan callos embriogénicos y embriones somáticos. De ningún otro órgano o tejido se ha logrado este proceso de morfogénesis.

Medio de cultivo.El medio utilizado para la obtención de células embrionarias somáticas es el medio MS (Bespalhok & Hattori, 1998; Venegas-Espinoza et al., 2017) obteniendo los resultados esperados.

Reguladores de crecimiento.Los tratamientos para la inducción de embriogénesis somática son básicamente las combinaciones de 2,4-D en 2 mg L^-1 y KIN 0.2 mg L^-1; en algunos casos se incluye tidiazurón (TDZ) 0.02 mg L^-1 y ácido abscísico (ABA) 3 mg L^-1 (Bespalhok & Hattori, 1998; Venegas-Espinoza et al., 2017).

Recientemente se encontró que para inducir estructuras globulares se utiliza el medio MS complementado con 2,4-D (4,5 µM) y BA (8,8 µM), luego, las estructuras globulares se transfieren al medio MS con 45 g de sacarosa L^-1 hasta la maduración de los embriones. Los embriones somáticos se trasvasan al medio MS sin reguladores de crecimiento y se obtienen plantas completas (Venegas-Espinoza et al., 2017).

Fuente de carbono. Los medios de cultivos para embriogénesis somática carecen de fuente de carbono hasta la formación de estructuras pre embrionarias, posteriormente para la maduración a embriones somáticos, se cambia a medios suplementados con sacarosa en concentraciones de 45 g L^-1 (Vanegas-Espinoza et al., 2017) hasta 60 mg L^-1 (Bespalhok & Hattori, 1998).

Condiciones de iluminación.En cuando a la iluminación, Vanegas et al. (2017) proponen la condición lumínica como factor crítico para embriogénesis somática, destacando que la incubación en oscuridad por cuatro semanas favorece el desarrollo de embriones somáticos.

En la Tabla 1 se resume cronológicamente los estudios realizados de morfogénesis in vitro en el género Tagetes, además resalta el tipo de explante, medio de cultivo, reguladores de crecimiento utilizados, y la respuesta morfogenética obtenida.

Table 1:In vitro morphogenesis studies of Tagetes erecta, UACh, Mexico (2021).

Tabla1: Estudios de morfogénesis in vitro de Tagetes erecta, UACh, México (2021).

Explante	Medio	Reguladores de crecimiento y extras	Respuesta	Cita
Flósculos inmaduros no polinizados	MS	5.0 mg L-1 de AIA + 3.0 mg L-1 de BA + 0.5 mg L-1 de GA3	brote	Kothari & Chandra, 1984
Hipocótilo	MS	1.0 mg L-1 de AIA + 3.0 mg L-1 de BA	brote	Belarmino et al., 1992
Hoja	MS	1.0 mg L-1 de AIA + 3.0 mg L-1 de BA	-	Belarmino et al., 1992
Cotiledones	MS	2.0 mg L-1 de 2,4-D + 0.2 mg L-1 de KIN; 3.0 mg L-1 de ABA + 0.02 mg L-1 de TDZ	callos embriogénicos y somáticos	Bespalhok & Hattori 1998
Callo de tallo	MS	0.5 mg L-1 de ANA + 1.0 mg L-1 de BA	brote	Bespalhok & Hattori 1998
Hoja	MS	5.0 mg L-1 de AgNO3 + 0.25 mg L-1 de BA	brote	Misra & Datta, 2001
Brote	MS	0.05 mg L-1 de ANA	raíz	Misra & Datta, 2001
Hoja	MS	0.5 mg L-1 de ANA + 1.0 mg L-1 de BA	brote	Vanegas et al., 2002
Tallo	MS	0.5 mg L-1 de ANA + 1.0 mg L-1 de BA	-	Vanegas et al., 2002
Hipocótilo	MS	0.5 mg L-1 de ANA + 1.0 mg L-1 de BA	callo	Vanegas et al., 2002
Hoja	MS	3.0 mg L-1 de AIA + 3.0 mg L-1 de BA	brotes	Vanegas et al., 2002
Hoja	MS	0.1 mg L-1 de ANA + 0.2 mg L-1 de BA	brote	YongMei & XueFang, 2005
Meristemo apical	MS	2.5 mg L-1 de AIB + 0.5 mg L-1 de ANA	brote	Bhardwaj et al., 2005
Brote	MS	2.5 mg L-1 de AIB + 0.2 % carbón	raíz	Bhardwaj et al., 2005
Ápice	MS	2.2 mg L-1 de AIA + 15.7 mg L-1 de BA	brotes	Miranda-Ham et al., 2006
Segmentos nodales	MS	0.5 mg L-1 de BA	brote	Turchetto et al 2007
Segmentos nodales	MS	BA >10 mg L-1	vitrificación	Turchetto, Peters & Braga, 2007
Segmentos nodales	¾ MS	¾ de NH4 NO3 + 50 g L-1 sacarosa	brote	Turchetto, Peters & Braga, 2007
Segmentos nodales	¾ MS	¾ de NH4 NO3 + 60 g L-1 sacarosa	botón floral	Turchetto, Peters & Braga, 2007
Segmentos nodales	MS	5.0 mg L-1 de AIA + 10.0 mg L-1 de BA + 40 g L-1 sacarosa	brote	Kumar et al., 2007
Callo de hoja	MS	3.0 mg L-1 de AIA + 3.0 mg L-1 de BA	brote	ZiGang et al., 2010
Hoja	MS	0.8 mg L-1 de AIA + 0.6 mg L-1 de BA	callos y yemas	HuaLi et al., 2011
Ovario maduro	MS	0.5 mg L-1 de 2,4-D + 0.5 mg L-1 de BA	callo	HuaLi et al., 2011
Callo de ovario	MS	0.05 mg L-1 de ANA +0.5 mg L-1 de BA	brote	HuaLi et al., 2011
Hoja	MS	2.0 mg L-1 de 2,4-D + 2.0 mg L-1 de BA	callo	Vanegas et al., 2011
Hoja (oscuridad)	MS	7.0 mg L-1 de ANA + 1.0 mg L-1 de BA	callo	Osman et al., 2012
Tallo (oscuridad)	MS	10.0 mg L-1 de ANA + 15.0 mg L-1 de BA	callo	Osman et al., 2012
Raíz (oscuridad)	MS	10.0 mg L-1 de ANA + 15.0 mg L-1 de BA	callo	Osman et al., 2012
Hoja	MS	2.0 mg L-1 de 2,4-D +2.0 mg L-1 de BA	callo	Vanegas et al., 2012
Hoja	MS	3.0 mg L-1 de AIA + 0.5 mg L-1 de BA	brote	Vanegas et al., 2012
Hoja	MS	0.1-0.9 mg L-1 de AIA; 0.1-0.7 mg L-1 de ANA + 0.1-1.0 mg L-1 de BA y KIN	Callo	Hussain & Latif, 2012
Entrenudo	MS	0.1-0.9 mg L-1 de AIA; 0.1-0.7 mg L-1 de ANA + 0.1-1.0 mg L-1 de BA y KIN	Callo	Hussain & Latif, 2012
Nodo	MS	0.1-0.9 mg L-1 de AIA; 0.1-0.7 mg L-1 de ANA + 0.1-1.0 mg L-1 de BA y KIN	Callo	Hussain & Latif, 2012
Pecíolo	MS	0.1-0.9 mg L-1 de AIA; 0.1-0.7 mg L-1 de ANA + 0.1-1.0 mg L-1 de BA y KIN	Callo	Hussain & Latif, 2012
Raíz	MS	0.1-0.9 mg L-1 de AIA; 0.1-0.7 mg L-1 de ANA + 0.1-1.0 mg L-1 de BA y KIN	-	Hussain & Latif, 2012
Meristemo apical	MS	0.1 mg L-1 de ANA + 0.5 mg L-1 de GA3 + 2 mg L-1 de BA	brote	Majumder et al., 2014
Meristemo apical	½ MS	0.5 mg L-1 de ANA + 1.0 mg L-1 de BA	raíz	Majumder et al., 2014
Hoja	MS	2.0 mg L-1 de 2,4-D + 5.0 mg L-1 de BA	callo	Nikam & Khan, 2014
Hoja	MS	5.0 mg L-1 de 2,4-D + 0.5 mg L-1 de KIN	callo	Deka & Arjuna, 2014
Hoja	MS	0.5 mg L-1 de AIA + 2.5 mg L-1 de KIN	raíz	Deka & Arjuna, 2014
Hipocótilo	MS	5.0 mg L-1 de GA3 + 1.5 mg L-1 de BA	brote	Gupta & Rhaman, 2015
Hoja	MS	2.0 mg L-1 de 2,4-D + 2.0 mg L-1 de BA	callo	Benitez et al., 2014
Flores liguladas	MS	2.0 mg L-1 de ANA + 5.0 mg L-1 de BA + 50 mg L-1 ácido ascórbico	callo	Nikam & Khan, 2015
Hoja	MS	2.0 mg L-1 de 2,4-D + 5.0 mg L-1 de BA	callo	Nikam & Khan, 2015
Callo de hoja	MS	1.0 mg L-1 de 2,4-D + 2.0 mg L-1 de BA	Embriones somáticos	Vanegas et al., 2017
Segmentos nodales	MS	0.1 mg L-1 de ANA + 2.0 mg L-1 de BA	brote	Kumar et al., 2018
Brote	½ MS	0.5 mg L-1 de ANA	raíz	Kumar et al., 2018
Ovario	MS	1 mg L-1 2,4-D + 1 mg L-1 de BA	callo	Thaneshwari, 2018
Hoja	MS	0.5 mg L-1de ANA + 2 mg L-1 de BA	raíz	Kumar et al., 2019
Hoja	MS	2.5 mg L-1 ANA + 5.0 mg L-1 BA	callo	Munshi et al., 2021
Hoja	MS	0.5 mg L-1 KIN + 1.0 mg L-1 BA	brotes	Munshi et al., 2021
Hoja	½ MS	1.0 mg L-1 AIB	raíz	Munshi et al., 2021

Table 2. In vitro morphogenesis studies of Tagetes minuta, UACh, Mexico (2021).

Tabla2. Estudios de morfogénesis in vitro deTagetes minuta, UACh, México (2021).

Explante	Medio	Reguladores de crecimiento y extras	Respuesta	Cita
	MS	0.1 mg L-1 de ANA	callo	Ekés-Kretovics et al., 1992
Cotiledón	MS	1.0 mg L-1 de AIA + 10.0 mg L-1 de BA	brote	Mohamed et al, 1998
Cotiledón	MS	3 mg L-1 AIA + 10 mg L-1 BA	callo	Mohamed et al, 2000

Table 3: In vitro morphogenesis studies ofTagetes patula, Universidad Autónoma Chapingo - UACh, Mexico (2021).

Tabla3:Estudios de morfogénesis in vitro deTagetes patula, Universidad Autónoma Chapingo - UACh, México (2021).

Explante	Medio	Reguladores de crecimiento y extras	Respuesta	Cita
Hoja	MS	1.5 mg L-1 de ANA + 1.0 mg L-1 de BA	Brote	YingChun et al., 2005
Anteras	MS	0.5 mg L-1 de ANA + 0.5 mg L-1 de BA	Callo	Qi et al, 2011
Meristemo apical	MS	0.1 mg L-1 de ANA + 1.5 mg L-1 de BA	Callo	RunDong et al, 2012
Tallo	MS	0.1 mg L-1 de ANA + 1.5 mg L-1 de BA	Callo	RunDong et al, 2012
Meristemo apical	½ MS	0.2 mg L-1 de ANA	Raíz	RunDong et al, 2012
Tallo	½ MS	0.2 mg L-1 de ANA	Raíz	RunDong et al, 2012
Hoja (oscuridad)	MS	7.0 mg L-1 de ANA + 10.0 mg L-1 de BA	Callo	Osman et al., 2012
Tallo (oscuridad)	MS	10.0 mg L-1 de ANA + 15.0 mg L-1 de BA	Callo	Osman et al., 2012
Raíz (oscuridad)	MS	7.0 mg L-1 de ANA + 10.0 mg L-1 de BA	Callo	Osman et al., 2012
Tálamo	MS	1.0 mg L-1 de BAP + 0.5 mg L-1 de KIN+ 1.0 mg L-1 AIA	Brote	Karjee et al., 2020

Table 4: In vitro morphogenesis studies ofTagetes lucida,Universidad Autónoma Chapingo -UACh, Mexico (2021).

Tabla4: Estudios de morfogénesis in vitro deTagetes lucida, Universidad Autónoma Chapingo - UACh, México (2021).

Explante	Medio	Reguladores de crecimiento y extras	Respuesta	Cita
Hoja	MS	1 mg L-1 de 2,4-D + 2 mg L-1 de BA	Callo	Rocha-Mendoza et al, 2013
Hoja	MS	3 mg L-1 de ANA + 0.5 mg L-1 de KI	Callo	Salvaña, 2019

Es importante tomar en cuenta las veces que se pueden subcultivar las especies en cultivo in vitro. Kothari & Chandra (1984), para T. erecta, recomiendan el subcultivo de brotes obtenidos de flósculos de disco cada 2 semanas, para preservar su morfogénesis. En contraste, los explantes foliares pierden su potencial después de tres subcultivos (75 días) (Kotari & Chandra 1986).

9. Conclusión

Aunque el protocolo de desinfección del material vegetal a usar varía según los tejidos u órganos, la mejor opción es iniciar con germinación de semillas para obtención de explantes, ya que las plantas adultas presentan gran cantidad de metabolitos secundarios, fenoles en particular, causando problemas para el establecimiento, además, las células menos especializadas responden mejor a los reguladores de crecimiento.

Los trabajos sobre morfogénesis in vitro de Tagetes, en su mayoría corresponden a organogénesis, después a callogénesis (para la obtención de metabolitos secundarios) y finalmente, a embriogénesis somática. Los inductores más importantes para callogénesis, organogénesis y embriogénesis somática son los reguladores de crecimiento por su relación directa con la diferenciación celular, por lo tanto son los más estudiados, destacando el tipo de regulador de crecimiento y su concentración; el efecto de estos inductores químicos varía dependiendo de la especie, como se ha visto entre Tagetes patula, T. erecta y T. minuta, que aunque son plantas herbáceas, sus respuestas de morfogénesis son diferentes, de ahí la importancia de particularizar protocolos de regulación de morfogénesis para cada especie o genotipo de Tagetes. Considerando que en los trabajos revisados la especie (genotipo) influye en la respuesta de morfogénesis, es importante mencionar diferencias en la ploidía de las especies que se han trabajado: T. erecta con 24 cromosomas (diploide) y T. patula48 cromosomas (tetraploide), por lo que, aunque estas sean muy parecidas, sus respuestas de morfogénesis son diferentes.

Para callogénesis, los explantes viables son: meristemo apical, hoja joven y ovario maduro; medio basal MS suplementado con ANA o 2,4-D, y BA. El uso del 2,4-D e incubación en oscuridad se recomienda para la generación de callos de buena calidad.

Para organogénesis directa o indirecta, el explante más promisorio es la hoja joven, en tanto que la concentración de la fuente de carbono (sacarosa) es importante para la inducción de morfogénesis, teniendo así que, en algunas especies de Tagetes, al trabajar con organogénesis a partir de explantes de hoja, tallo o raíz, la cantidad adecuada es 30 g L^-1, a diferencia de usar segmentos nodales, donde se ha visto que aumentando la cantidad de sacarosa de 30 a 50, o de 30 a 60 g L^-1, se forman brotes y botones florales, respectivamente. Cuando se trata de embriogénesis, para formar la estructura pre embrionaria, la cantidad de sacarosa es la mencionada anteriormente, pero para obtener un embrión somático maduro, la concentración de sacarosa es de 45 a 60 g L^-1. Es importante resaltar que la fuente de carbono por sí sola no logra el efecto de morfogénesis, sino que es un estímulo que actúa en sinergia con el tipo de explante, tipo de regulador de crecimiento y condiciones de iluminación.

El uso de auxinas y citocininas es necesario para lograr organogénesis en Tagetes, como también el empleo de giberelinas para inhibir la formación de callos, y en el caso de que se trabaje con segmentos de ápice de hoja, es recomendable utilizar AgNO₃como inhibidor del etileno ya que esa zona de la hoja es la que madura más rápido y produce dificultad en la respuesta de morfogénesis, a diferencia de segmentos de la parte media y de la base de la hoja. Para la formación de embriones somáticos vía indirecta, los mejores reguladores de crecimiento son 2,4-D y BA, utilizando como explante el hipocótilo.

La implementación experimental de algunos de los factores exitosos para la morfogénesis en especies aún no exploradas en su capacidad de totipotencialidad, permitirán determinar la importancia que tiene el genotipo de Tagetes en la respuesta de morfogénesis in vitro, toda vez que este taxón se integra de especies anuales y perennes, terrestres y subacuáticas, con distinto tamaño de genoma, número cromosómico diploide y poliploide, filogenéticamente variable, químicamente y morfológicamente diversas, de amplia adaptación al ambiente y también endémicas, y de condición ruderal, arvense, silvestre, cultivadas y también domesticadas.

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